Dag ¾ & 4/4

Random priming    +    Southern blot (= Gelelektrofores + Southern transfer + Fixering av DNA till membran + Prehybridisering  +  Hybridisering)

+  Stringenstvätt    +   Detektion

Fig. 1 Foto av nylonmembran

    Spalt 1: Plasmidprep

   Spalt 2: Markör IX  

                 Spalt 3: Klyvd plasmid 0,5µg

                     Spalt 4: Klyvd plasmid 0,005µg

   Spalt 5: Markör III    

Det har bildats band i spalt 2,3 & 4  (Fig. 1) där proben har bundit specifikt till LL37, genom att substratet i detektionsbufferten reagerar med alkaliskt fosfatas enzymet.     

Spalt 2 & 5 (Fig. 1) som motsvarar markörerna har ingen band. Detta tyder på att stringenstvätten har lyckats eftersom proben har inte bundit ospecifikt till annat DNA än LL37.

I spalt 1 finns ett tjockt band som motsvarar den oklyvda pDNA innehållande inserten LL37. Resten av banden som syns är bl.a. open circular pDNA eller pDNA (pBlue + LL37) som har klyvts och blivit helt linjära.

I både spalt 3 & 4 (Fig. 1) finns ett tjockt band där proben har bundit till LL37. Banden som syns ovanpå de motsvarande LL37 är linjära DNA som innehåller både pBlue så väl som LL37. Såna DNA fragment bildas pga. otillräklig klyvning.

Diskutera för- och nackdelar med PCR och Southern blot.

PCR är en metod med mycket färre steg än Southern blot. För detta anledning finns det betydligt högre risk att göra fel med Southern blot än PCR.

PCR är en väldig känslig metod där det finns risk för ”carry over” kontamination. Men, metoden är relativt enkel att göra om ifall en ”carry over” kontamination  upptäcks i den negativa kontrollen. Att göra om Southern blot kräver längre tid och mycket mer material än PCR.

Southern blot är en känslig  metod jämfört med gelelektrofores. I spalt 4 (Fig. 1) har det bildats ett tjockt band på ca 550bp motsvarande LL37 till skillnad från elektroforesgelen som visade inget band alls. Detta visar att man kan detektera väldigt små mängder av en specifik gen, så pass små mängder att det inte går att detektera på gelektrofores, mha. Southern blot.  

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Det viktigaste jag har lärt mig, förutom hur Southern blotting och PCR fugerar, är hur viktigt det är att ha en förtåelse och översiktlig bild av hela laborationen redan från början, så att man förstår syftet av varje steg man utför på lab.