Dag ¾ & 4/4

Random priming    +    Southern blot (= Gelelektrofores + Southern transfer + Fixering av DNA till membran + Prehybridisering  +  Hybridisering)

+  Stringenstvätt    +   Detektion

Fig. 1 Foto av nylonmembran

    Spalt 1: Plasmidprep

   Spalt 2: Markör IX  

                 Spalt 3: Klyvd plasmid 0,5µg

                     Spalt 4: Klyvd plasmid 0,005µg

   Spalt 5: Markör III    

Det har bildats band i spalt 2,3 & 4  (Fig. 1) där proben har bundit specifikt till LL37, genom att substratet i detektionsbufferten reagerar med alkaliskt fosfatas enzymet.     

Spalt 2 & 5 (Fig. 1) som motsvarar markörerna har ingen band. Detta tyder på att stringenstvätten har lyckats eftersom proben har inte bundit ospecifikt till annat DNA än LL37.

I spalt 1 finns ett tjockt band som motsvarar den oklyvda pDNA innehållande inserten LL37. Resten av banden som syns är bl.a. open circular pDNA eller pDNA (pBlue + LL37) som har klyvts och blivit helt linjära.

I både spalt 3 & 4 (Fig. 1) finns ett tjockt band där proben har bundit till LL37. Banden som syns ovanpå de motsvarande LL37 är linjära DNA som innehåller både pBlue så väl som LL37. Såna DNA fragment bildas pga. otillräklig klyvning.

Diskutera för- och nackdelar med PCR och Southern blot.

PCR är en metod med mycket färre steg än Southern blot. För detta anledning finns det betydligt högre risk att göra fel med Southern blot än PCR.

PCR är en väldig känslig metod där det finns risk för ”carry over” kontamination. Men, metoden är relativt enkel att göra om ifall en ”carry over” kontamination  upptäcks i den negativa kontrollen. Att göra om Southern blot kräver längre tid och mycket mer material än PCR.

Southern blot är en känslig  metod jämfört med gelelektrofores. I spalt 4 (Fig. 1) har det bildats ett tjockt band på ca 550bp motsvarande LL37 till skillnad från elektroforesgelen som visade inget band alls. Detta visar att man kan detektera väldigt små mängder av en specifik gen, så pass små mängder att det inte går att detektera på gelektrofores, mha. Southern blot.  

Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Det viktigaste jag har lärt mig, förutom hur Southern blotting och PCR fugerar, är hur viktigt det är att ha en förtåelse och översiktlig bild av hela laborationen redan från början, så att man förstår syftet av varje steg man utför på lab.

Dag 2/4

PCR + Gelektrofores + Klyvning av pDNA

Syfte: Bekräfta att vi har en rek. plasmid samt verifiera att inserten är LL37 (PCR + gelelektrofores). Klyva pDNA med EcoR1 för att separera vektorn och inserten (klyvning).                     

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Efter genomförd elektrofores, ställdes gelen i ett UV-kabinett och fotograferades (Fig. 1).

 Fig. 1 Foto av elektroforesgel. 

  Brunn 1: Markör III

    Brunn 2: Plasmidprep

         Brunn 3: Negativ kontroll

           Brunn 4: Prov (Amplifikat)

        Brunn 5: Positiv kontroll

Brunn 6: Markör IX

                                                                                                                

Resultatet blev positivt. LL-37 finns i rek. pDNA som renades från E.coli. bakterierna.

Resultatets tillförlitlighet kontrollerades mha. en positiv så väl som negativ kontroll. En negativ kontroll användes för att bekräfta att resultatet inte är falskt positivt pga. "carry over" kontamination.  Ingen band syns i spalt 3 motsvarande den negativa kontrollen, detta tyder på att ingen "carry over" kontamination har skett. Den positiva kontrollen är amplifierade produkten av en känd LL-37 gen. I både spalt 4 och 5 finns ett tjockt band på ca 550bp motsvarande LL37 genen. Detta är ytterligare ett bevis på att systemet har fungerat bra/som det ska och att det positiva resultatet är tillförlitligt.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Nej, inte för tillfället.

Dag ¼

Rening av rek. plasmid + Konc. och renhetsbestämning av plasmidprep

         Syfte: Separarera rek. plasmid (pDNA) från övrigt cellinnehåll samt bestämma konc. 
         av plasmidprepen och verifiera dess renhet genom absorbansmätning.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
I det här fallet, alla komponenter av bakteriecellerna förutom pDNA är i princip föroreningar. Föroreningarna som har tagits bort är kromosomalt DNA, celldebris, proteiner så väl som RNA.

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Absorbansen (abs) av 100x sp. plasmidlösning mätes mellan 230-300nm. Vid 260nm där nukleinsyror har sin abs. max var abs.= 0,054 (Fig. 1). Däremot, vid 280nm där proteiner har sin max abs. var abs. = 0,029 (Fig. 2).

Fig. 1 Absorbanskurva som visar absorbansvärdet vid 260nm.

Fig. 2 Absorbanskurva som visar absorbansvärdet vid 280nm.

Kvoten mellan abs. vid 260nm och 280nm ligger på ca 1,86. En ren plasmidprep skall ge en kvot mellan 1,6-1,9 (1). I enlighet med detta, kan det konstateras att plasmidprepen är mer eller mindre ren.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Nej, inte för tillfället.

Litteraturförteckning

1.      Karls, M. Nordvall-Bodell, A. Laborationskompendium: Molekylärbiologisk metodik. Kursen: Molekylärbiologi och Molekylärbiologisk metodik, Karolinska Institutet, HT 2012.